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問題
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可能原因
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驗證或解決辦法
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背景較高
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封閉不充分
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延長封閉時間，更換合適的封閉劑(脫脂奶粉，BSA,血清等)
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一抗濃度過高
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增加一抗稀釋倍數，
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抗體孵育溫度過偏高
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建議4℃孵育
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二抗非特異性結合
或與封閉劑交叉反應
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設置二抗對照(不加一抗),降低二抗濃度
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一抗或二抗與封閉劑有交叉反應
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在孵育和洗滌液中加入Tween-20以減少交叉反應.
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洗膜不充分
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增加洗滌次數
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膜不合適
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NC膜比PVDF膜背景低
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膜干燥
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保證充分的反應液，避免出現干膜現象
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沒有陽性條帶 或很弱
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一抗、二抗等不匹配
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訂購試劑時認真選取一抗與組織種屬， 一抗與二抗或/和底物與酶 系統之間相匹配的抗體及底物。可通過設置內參可以驗證二級檢測 系統的有效性。
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-抗或/和二抗濃度低
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增加抗體濃度，延長孵育時間
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封閉劑與一抗或二抗有交叉反應
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封閉時使用溫和的去污劑，如TWEEN20,或更換封閉劑(常用的 脫脂奶、BSA、血清或明膠
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一抗不識別目的物種的靶蛋白
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檢查說明書，或做ClustalW比對，設陽性對照
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樣本中無靶蛋白或靶蛋白含量過 低(抗原無效)
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設置陽性對照，如果陽性對照有結果，但標本沒有則可能是標本中 不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。后者可增加標本上樣量至少每孔 20-30ug蛋白，樣本制備時使用蛋白酶抑制劑，或分級提取目的蛋白。
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轉膜不充分，或洗膜過度
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使用麗春紅S檢測轉膜效果，PVDF膜需浸透，需正確的轉膜操作，勿 過度洗膜
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過度封閉
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使用含0.5%脫脂奶或無脫脂奶的抗體稀釋液，或更換封閉劑，減少 封閉時間
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一抗失效
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使用有效期內抗體，分裝保存，避免反復凍融取用，工作液現配現用
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二抗受疊氮鈉抑制
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所用溶液和容器中避免含有疊氮鈉(HRP的抑制劑)
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酶和底物失效
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直接將酶和底物進行混合，如果不顯色則說明酶失活了、選擇在有 效期內、有活性的酶聯物，使用新鮮的底物.
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曝光時間過短
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延長曝光時間
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多非特異性條 帶
或條帶位置不 對
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細胞傳代次數過多，使其蛋白表 達模式的分化
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使用原始或傳代少的細胞株，或平行實驗
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體內表達的蛋白樣本具有多種修 飾形式：乙?；⒘姿峄⒓谆?nbsp;化、烷基化、糖基化等
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查文獻，使用去修飾的試劑使蛋白恢復其正確的大小
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蛋白樣本降解
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使用新鮮制備的標本，并使用蛋白酶抑制劑
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新蛋白或同族蛋白的分享同種表 位的不同剪接方式
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查其它文獻報導，或BLAST搜尋，使用說明書報導的細胞株或組織
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一抗濃度過高
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降低抗體濃度，可以減少非特異性條帶
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二抗濃度過高產生非特異性結合
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降低抗體濃度，增加二抗對照
選擇特異性更強，只針對重鏈的二抗
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抗體未純化
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使用單克隆或親和純化的抗體，減少非特異條帶
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蛋白存在二聚體或多聚體
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SDS-PAGE電泳上樣前，煮沸10 min,
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